近期武漢生物制品研究所與國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心等團(tuán)隊在《中國生物制品學(xué)雜志》發(fā)表關(guān)于多類型生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備病毒的成果比較，該研究為不同類型生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備病毒，以及放大培養(yǎng)提供了技術(shù)支持，為后期更大規(guī)模攪拌式生物反應(yīng)器高密度貼壁細(xì)胞培養(yǎng)病毒奠定基礎(chǔ)。
目的：
比較攪拌式生物反應(yīng)器、籃式生物反應(yīng)器和搖床生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備柯薩奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)的效果。
方法：
分別采用2L搖床生物反應(yīng)器(預(yù)輻照片狀載體袋)、15L籃式生物反應(yīng)器(片狀載體)和40L攪拌式生物反應(yīng)器(球狀載體)培養(yǎng)Vero細(xì)胞，制備CV-A10，比較不同類型生物反應(yīng)器細(xì)胞貼壁效率、營養(yǎng)代謝物質(zhì)含量、細(xì)胞生長特性以及病毒滴度和抗原含量差異。
結(jié)果：
攪拌式生物反應(yīng)器僅需適當(dāng)攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細(xì)胞的充分混勻。攪拌式生物反應(yīng)器，搖床生物反應(yīng)器、籃式生物反應(yīng)器均可用于Vero細(xì)胞的穩(wěn)定培養(yǎng)和CV-A10的高效制備，其中攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)時間短，病毒滴度更高。
01 背景
生物反應(yīng)器是模擬細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境并在體外進(jìn)行生物培養(yǎng)的系統(tǒng)，其能實現(xiàn)細(xì)胞在體外的高密度增長，高效地產(chǎn)出具有醫(yī)藥價值的酶、單抗、疫苗等目標(biāo)產(chǎn)物。動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，對剪切力非常敏感，為避免細(xì)胞損傷，通常需要對生物反應(yīng)器進(jìn)行一定改進(jìn)，如改進(jìn)攪拌槳、供氣方式、加裝輔件等，從而優(yōu)化細(xì)胞生長環(huán)境。生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程及培養(yǎng)方式具有復(fù)雜性，不同類型的生物反應(yīng)器和生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程參數(shù)均會對細(xì)胞生長和病毒增殖產(chǎn)生影響。該研究基于Vero細(xì)胞和CV-A10，比較搖床生物反應(yīng)器(預(yù)輻照片狀載體袋)、籃式生物反應(yīng)器(片狀載體)和攪拌式生物反應(yīng)器(球狀載體)培養(yǎng)Vero細(xì)胞和CV-A10的差異性，以期建立Vero細(xì)胞和CV-A10高密度、高產(chǎn)量培養(yǎng)方法，為開發(fā)包含CV-A10的HFMD多價滅活疫苗提供工藝數(shù)據(jù)支持。
02 結(jié)果
2.1不同類型生物反應(yīng)器細(xì)胞貼壁效率
攪拌式生物反應(yīng)器接種細(xì)胞后0.5、1.5、2.5和3.5 h，上清中游離細(xì)胞占比分別為68.33%、57.00%、48.00%和30.00%，接種細(xì)胞后3.5 h，上清中有30.00%細(xì)胞未貼附至球狀載體上面，見圖1
圖1細(xì)胞貼壁效率曲線
2.2不同類型生物反應(yīng)器營養(yǎng)代謝物質(zhì)含量
不同類型生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)過程中，葡萄糖含量變化曲線基本保持一致，均呈先下降后上升趨勢。不同類型生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)過程中，乳酸含量變化曲線基本保持一致，均呈先上升后下降趨勢，細(xì)胞培養(yǎng)第3～4天時，乳酸含量最高，見圖2。
圖2葡萄糖（A）和乳酸（B）含量變化曲線
2.3不同類型生物反應(yīng)器細(xì)胞生長特性
Vero細(xì)胞在2L搖床生物反應(yīng)器和40L攪拌式生物反應(yīng)器的細(xì)胞生長曲線均呈S型。
2L搖床生物反應(yīng)器、15L籃式生物反應(yīng)器與40L 攪拌式生物反應(yīng)器病毒收獲液抗原含量分別為2 899～5 341、3 932～6 086和3 322～4 262 U/mL。
2L搖床生物反應(yīng)器、15L籃式生物反應(yīng)器和40L 攪拌式生物反應(yīng)器病毒收獲液病毒滴度分別為7.750～8.500、7.875～8.250和8.375～9.000 lg CCID50/mL。
攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)時間短，病毒滴度高，這主要是因為攪拌式生物反應(yīng)器僅需適當(dāng)攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細(xì)胞的充分混勻。2L搖床生物反應(yīng)和15L籃式生物反應(yīng)器由于片狀載體傳質(zhì)交換較弱，接種或細(xì)胞釋放的病毒與片狀載體內(nèi)腔空隙結(jié)構(gòu)生長的Vero細(xì)胞的混勻效果較差。此外，相比于球狀載體，片狀載體由于傳質(zhì)效果更差，載體中殘留病毒量可能更多。球狀載體培養(yǎng)的細(xì)胞更易由于球狀載體間的相互碰撞，受感染的細(xì)胞更脆弱，病毒能更快地從感染細(xì)胞中釋放出來。
圖3C：40L攪拌式生物反應(yīng)器細(xì)胞形態(tài)（× 100）
03 討論
在攪拌式生物反應(yīng)器中，球狀載體貼壁120min后，貼壁效率能達(dá)到約90%。該研究中，攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)時間短，病毒滴度高，攪拌式生物反應(yīng)器僅需適當(dāng)攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細(xì)胞的充分混勻。此外，相比于球狀載體，片狀載體由于傳質(zhì)效果更差，載體中殘留病毒量可能更多。球狀載體培養(yǎng)的細(xì)胞更易由于球狀載體間的相互碰撞，受感染的細(xì)胞更脆弱，病毒能更快地從感染細(xì)胞中釋放出來。說明攪拌式生物反應(yīng)器球狀載體培養(yǎng)同樣能用于CV-A10的穩(wěn)定、高效生產(chǎn)，在未來對攪拌式生物反應(yīng)器不斷地工藝優(yōu)化中，可以實現(xiàn)更好的產(chǎn)量。
該研究將進(jìn)一步提高培養(yǎng)效率，加快應(yīng)對突發(fā)傳染病疫苗研發(fā)的速度。Vero細(xì)胞和CV-A10在攪拌式生物反應(yīng)器中的成功放大，為其在包括CV-A10的HFMD多價滅活疫苗和未來新發(fā)突發(fā)傳染病疫苗中的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。
應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞是病毒制備的關(guān)鍵技術(shù)，是重要的發(fā)展方向之一。生物反應(yīng)器易操控，適合規(guī)模化放大，應(yīng)用攪拌式反應(yīng)器球狀載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞具有明顯優(yōu)勢。生物反應(yīng)器培養(yǎng)可獲得更高的收益率，生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)可以完成更多工作，可監(jiān)測和控制的參數(shù)數(shù)量基于生物反應(yīng)器中的傳感器和控制元件數(shù)量，可以更好的進(jìn)行培養(yǎng)工藝條件的篩選，優(yōu)化。工藝簡單、操作靈活，有良好的適用性；培養(yǎng)工藝容易放大，可為生物體生長和增殖提供均質(zhì)的環(huán)境；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)；提供較好的無菌條件，細(xì)胞生長過程中不易污染。
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DOI：10.13200/j.cnki.cjb.004309
