CRISPR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)帶來了一種高效、可靠、方便的基因組編輯工具的希望。但是，過去用Cas9靶標(biāo)多個基因組位點需要構(gòu)建多個或者很大的表達(dá)載體，CRISPR-Cas9編輯技術(shù)的應(yīng)用具有一定的局限性。而多重基因組編輯技術(shù)可以高精度的修改基因組中兩個或多個特定的DNA位點，大大增加了在多個核苷酸水平上向目標(biāo)基因組引入突變的可行性。

CRISPR核酸酶和向?qū)NA(gRNA)被用來在基因組中引入雙鏈斷裂(DSB)，基因組編輯的準(zhǔn)確性和效率受到細(xì)胞DSB修復(fù)途徑的影響，這些修復(fù)途徑包括同源定向修復(fù)(HDR)、非同源端連接(NHEJ)、微同源介導(dǎo)的末端連接(MMEJ)等^[1]。NHEJ是大多數(shù)真核生物修復(fù)DSB的主要細(xì)胞修復(fù)途徑，但常常因能引入indel從而導(dǎo)致移碼突變；而HDR通常使用姐妹染色單體作為同源修復(fù)模板來精準(zhǔn)修復(fù)攜帶DNA斷裂的染色體，從而實現(xiàn)精確的基因組編輯(PGE)，但效率比較低。

德國馬克斯普朗克進(jìn)化人類學(xué)研究所研究人員Stephan Riesenberg等人分享一種基于CRISPR-Cas9的多重基因組編輯，利用PRKDC基因突變和激酶抑制劑M3814抑制DNA依賴性蛋白激酶的催化亞單位(DNA-PKcs)活性，增加基因編輯HDR效率，使得在同一個細(xì)胞中同時精確編輯多達(dá)4個基因的方法^[2]。

人類細(xì)胞PRKDC基因的

K3753R突變可促進(jìn)HDR

為了提高靶向DSB的基因編輯效率，減少DSB的脫靶可能，建立人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)細(xì)胞系{在含Matrigel Matrix (Corning, 35248)的板中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為每天更換補充劑 (StemCell Technologies, 05852) 的mTeSR1 培養(yǎng)基 (StemCell Technologies, 05851)}，攜帶D10A突變的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型Cas9(iCRISPR-Cas9n)，使其誘導(dǎo)DNA單鏈斷裂^[3]。hiPSC引入編碼DNA-PKcs蛋白的PRKDC基因的K3753R突變，致其失活，對比DNA-PKcs K3753R(KR)和DNA-PKcs野生型(WT)細(xì)胞中引入核苷酸替換的效率。

設(shè)計gRNAs和14種單鏈寡脫氧核苷酸供體(ssODNs)，強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)Cas9n表達(dá)，轉(zhuǎn)染gRNAs和ssODN。培養(yǎng)3天后分離DNA，PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因并測序，鑒定ssODNs通過HDR插入靶標(biāo)基因的效率。當(dāng)單獨編輯每個基因時，WT細(xì)胞中的HDR頻率在14個基因中變化在4%到40%之間(平均18%)(圖1A)；在KR細(xì)胞中，頻率在15%到81%之間(平均51%)(圖1B)。在這些基因中，KR細(xì)胞的HDR增加了1.6倍到6.8倍(平均3.3倍)(圖1C)。在KR細(xì)胞中，MMEJ相對于NHEJ增加(圖1D)，NHEJ被抑制，導(dǎo)致HDR急劇增加(圖1E)。

圖1：失活DNA-PKcs可促進(jìn)HDR

選取KR細(xì)胞中HDR頻率低的3個基因，使用Cas9替代Cas9n，其中兩個基因的HDR分別從35%和20%增加到73%和87%(圖2A)。因此，對于一些MMEJ占主導(dǎo)的靶點，可以通過使用不同的核酸酶提高PGE，以基因VCAN中Cas9n和Cas9編輯后的缺失模式為例，不同的切割位點，導(dǎo)致HDR頻率的不同(圖2B)。

圖2：不同核酸酶在KR細(xì)胞系中HDR頻率變化

為了測試在hiPSCs中看到HDR的增加是否依賴于細(xì)胞類型或使用的酶，基因編輯HEK293細(xì)胞{(ECACC, 85120602)，培養(yǎng)基為含 10% 胎牛血清 (FBS) (SIGMA, F2442) 和 1%NEAA(SIGMA, M7145）的Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基/F-12 (Gibco, 31330-038)}和K562細(xì)胞{(ECACC, 89121407) ,培養(yǎng)基為含10% FBS的 Iscove 改良的 Dulbecco 培養(yǎng)基 (ThermoFisher, 12440053)}，在單細(xì)胞打印機(jī)分選基因編輯后的單克隆細(xì)胞，進(jìn)行文庫制備和Illumina測序。分別對比在KR和WT中使用不同核酸酶Cas9n、Cas9和Cpf1的基因組編輯頻率情況。可以發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞系、不同核酸酶下，DNA-PKcs蛋白的PRKDC基因的K3753R突變都會引起HDR頻率的增加（圖3）。

圖3：不同DNA-PKcs K3753R細(xì)胞系能促進(jìn)HDR

將四種不同基因的成對組合在誘導(dǎo)Cas9n表達(dá)后電穿孔到iPSC的KR細(xì)胞中。409-B2 iCRISPR-Cas9n hiPSC 在編輯前三到四天在含有 2 g/ml 強(qiáng)力霉素 (Clontech, 631311) 的培養(yǎng)基中孵育。對于多重精確基因組編輯，在電穿孔前一天將該培養(yǎng)基更換為含有補充劑 (Gibco, A3349401)、CloneR (StemCell Technologies, 05888) 和強(qiáng)力霉素的 StemFlex。90% 的電穿孔細(xì)胞被鋪板用于批量基因型分析，10% 的 hiPSC 被鋪板在6 孔板中以產(chǎn)生源自單細(xì)胞的克隆，在電穿孔后 2 天，培養(yǎng)基中添加了 ROCK 抑制劑 Y-27632。至少 7 天后，挑選單克隆用于后續(xù)繁殖和 DNA 分離。當(dāng)同時編輯兩個基因時的HDR頻率都與對應(yīng)基因的單編輯相似或略低(圖4A)；對于三個基因的三種不同組合，HDR效率平均比單個編輯低三分之一，導(dǎo)致每個目標(biāo)位點的平均編輯頻率為40%(圖4B)；對于4個或5個基因，平均HDR頻率分別下降到13%和8%(圖4C)。此外，細(xì)胞存活率從2次編輯的30-68%下降到5次編輯的11%(圖4E)。

對于三重編輯，分選的單細(xì)胞來源的克隆(SCCs)中大約有三分之一以純合子的形式攜帶所有目標(biāo)基因(6條染色體)；四重基因編輯的SCCs中有6%的4個氨基酸替換的純合子細(xì)胞克隆，比預(yù)期高出1000倍(圖4D)。這表明，具有“編輯能力"的細(xì)胞往往會在多個位點上被有效編輯。

圖4：利用失活DNA-PKcs細(xì)胞系進(jìn)行多重精確基因組編輯

表達(dá)失活的DNA-PKcs的細(xì)胞

的基因組穩(wěn)定性不受影響

為了驗證失活409B2-iCRISPR iPSC的DNA-PKcs催化活性是否導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，使用Trypsin-Giemsa Banding(GTG)試劑和光譜核型分析(SKY)核型分析，顯示KR-KCS克隆中觀察到一個多倍體中期染色體(圖5B)。此外，用DSB誘導(dǎo)藥物博萊霉素處理表達(dá)WT和KR細(xì)胞，KR細(xì)胞比WT細(xì)胞的存活率降低高兩倍(圖5C)。經(jīng)博萊霉素處理后，50個WT細(xì)胞中有4個中期染色體出現(xiàn)不平衡易位，50個KR細(xì)胞中有2個中期染色體出現(xiàn)平衡易位。因此，與WT細(xì)胞相比，KR細(xì)胞的非整倍體或染色體重排沒有增加(圖5D)。

為了評估其他類型的遺傳不穩(wěn)定性，對DNA-PKcs WT、WT細(xì)胞傳代48次后生成KR克隆、KR細(xì)胞傳代24次后生成三編輯克隆KR-KSC(KATNAI-SLITRKI-CALDI編輯)(圖5A)進(jìn)行全基因組測序。比較沿著染色體1mb基因組覆蓋率，與WT相比，KR和KR-KSC的差異是9號染色體覆蓋率下降，表明存在雜合缺失(圖5E)。全基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在KR和KR- KSC細(xì)胞之間共有19個新的雜合單核苷酸變異(SNV)，在KR- KSC細(xì)胞中有3個新的雜合SNV；沒有發(fā)現(xiàn)三個細(xì)胞系之間的indel有什么不同。按全基因組結(jié)果推算，WT細(xì)胞傳代的突變率為21,KR細(xì)胞為7，證明KR以及KR-KSC均沒有提高突變的概率。

圖5：DNA-PKcs K3753R細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性

在KR細(xì)胞中提高核苷酸替換的效率，引入所需的改變后，恢復(fù)正常的DNA-PKcs功能成為可能，可以通過暫時抑制DNA-PKcs的激酶活性來增加HDR。M3814是一種新型高效的DNA-PKcs抑制劑，基因編輯的細(xì)胞在電轉(zhuǎn)后分別使用或不使用2 μM的M3814處理3天后，用單細(xì)胞打印機(jī)(Cytena)分選單克隆細(xì)胞，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制作Illumina文庫并進(jìn)行測序。

結(jié)果顯示，在WT K562細(xì)胞中Cas9誘導(dǎo)的DSB的HDR從18%增加到81%，同時表現(xiàn)出中等毒性，409B2 hiPSCs的HDR也出現(xiàn)了類似的增加(圖6A和6B)。與其他DNA-PK抑制劑相比，M3814使得HDR增加的效果更好(圖6C)。為了探索這種明顯的高編輯效率是否可能是由于誘導(dǎo)目標(biāo)DNA序列的大量缺失，在無M3814和有M3814編輯后分離單克隆細(xì)胞，通過擴(kuò)增子測序發(fā)現(xiàn)，當(dāng)M3814未被使用時，10%的克隆以純合子狀態(tài)替換核苷酸；而使用M3814時，替換正確的克隆達(dá)到76%。另外，M3814同樣增加了多重基因組編輯的HDR(圖6D和6E)。因此，通過可逆性K3753R突變或M3814抑制DNA-PKcs的激酶活性，可以顯著增加PGE，允許在人類細(xì)胞中同時引入多個核苷酸替換。

圖6：小分子M3814對DNA-PKcs瞬時失活的影響

本篇文章展示人類細(xì)胞可以利用PRKDC基因的K3753R突變提高基因編輯中PGE的效率，并且可以和小分子M3814結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)HDR。在這種方法下，沒有發(fā)現(xiàn)K3753R突變會降低基因組穩(wěn)定性；在博萊霉素處理后易位更少，每次傳代的突變也更少。易出錯的NHEJ的損傷可能會導(dǎo)致細(xì)胞通過不易出錯的HDR更頻繁地修復(fù)DSB，否則細(xì)胞可能會發(fā)生凋亡，導(dǎo)致存活的細(xì)胞以更準(zhǔn)確的形式維持其基因組。DNA-PKcs抑制劑M3814能夠在一定程度上增加HDR，與PRKDC突變可以達(dá)到相當(dāng)?shù)某潭?。DNA-PKcs失活會導(dǎo)致哺乳動物因無法進(jìn)行V(D)J重組而產(chǎn)生嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷，因此M3814可以在基因治療中使用，提高HDR效率來實現(xiàn)治療目標(biāo)。

基因編輯作為21世紀(jì)偉大的科學(xué)成就之一，具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。為了獲得基因編輯成功的細(xì)胞株，需要在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞池中富集并克隆以創(chuàng)建統(tǒng)一的單克隆細(xì)胞系，以待進(jìn)一步的表征。傳統(tǒng)的分選方法如有限稀釋法耗時耗力、效率低下；FACS分選的細(xì)胞容易受到鞘液壓力的影響而受損，導(dǎo)致單克隆率低。同時，這兩種方法都無法提供單細(xì)胞來源的證明，無法滿足監(jiān)管部門的要求。

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表1：單細(xì)胞打印機(jī)參數(shù)